Im Folgejahr, am 28. August 1865, begann das Zeitalter der Straßenbahn in Deutschland. Die erste Pferdebahnlinie Berlins nahm den Betrieb auf, sie führte vom Kupfergraben an der heutigen Museumsinsel über die heutige Straße des 17. Juni nach Charlottenburg. Wie zuvor beim Pferdebus, so folgten auch hier viele weitere Unternehmer der neuen Entwicklung und bauten in allen Teilen des heutigen Stadtgebiets Pferdebahnstrecken. 1873 eröffnete eine Strecke vom Rosenthaler Platz zum Gesundbrunnen, Betreiberin war die neu gegründete Große Berliner Pferde-Eisenbahn, die später unter dem Namen Große Berliner Straßenbahn (GBS) zum dominierenden Verkehrsunternehmen Berlins werden sollte.

Am 16. Mai 1881 schrieb die Region Berlin erneut Verkehrsgeschichte. In der Gemeinde Groß-Lichterfelde, die erst 39 Jahre später ein Teil von Berlin-Steglitz wurde, eröffnete Werner von Siemens die erste elektrische Straßenbahn der Welt. Die Strecke diente zunächst nur als Versuchsanlage, Siemens bezeichnete sie als „von den Säulen und Trägern genommene Hochbahn“, denn sein eigentliches Ziel war der Bau eines elektrischen Hochbahnnetzes in Berlin. Um die zögernden politischen Entscheidungsträger von den Vorteilen des elektrischen Antriebs zu überzeugen, wählte Siemens die Kleinbahnstrecke in Lichterfelde als Demonstrationsobjekt. Die Bedenkenträger im Magistrat behielten trotzdem weiterhin die Oberhand, und Siemens konnte die erste Berliner Hochbahnstrecke erst 21 Jahre später in Betrieb nehmen (siehe Geschichte der Berliner U-Bahn).

Die elektrische Straßenbahn in Lichterfelde erhielt ihren Fahrstrom über die Gleise, sodass die Strecke aus Sicherheitsgründen eingezäunt werden musste. Die meterspurige Strecke verlief vom heutigen S-Bahnhof Lichterfelde-Ost zur Kadettenanstalt in der Finckensteinallee. Eine Fahrt kostete mehr als ein damaliger Durchschnittsstundenlohn. Die Strecke wurde am 15. Februar 1930 stillgelegt und durch eine Buslinie ersetzt.

Der elektrische Betrieb verlief zunächst noch nicht zufriedenstellend, und es blieb bei der einen Versuchsstrecke. Die Elektrifizierung der Pferdebahnstrecken begann wie in anderen Städten erst am Ende des Jahrhunderts. Am 1. Mai 1896 eröffnete die GBS die erste elektrische Strecke von der Innenstadt zum Gelände der Gewerbeausstellung in der Gemeinde Treptow. Der elektrische Betrieb lieferte diesmal bessere Ergebnisse, sodass in der Folge immer mehr Strecken elektrifiziert wurden, bis im Jahr 1902 fast alle Linien elektrisch betrieben wurden.

Ab dem 18. Dezember 1899 konnte man in Berlin aber bereits, trotz der Hindernisse bei der Planung der U-Bahn, unterirdisch Bahn fahren, sogar unter der Spree hindurch: Der zur Gewerbeausstellung 1896 schon gezeigte, 450 Meter lange Spreetunnel zwischen Treptow und Stralau wurde der Straßenbahn übergeben. Der Tunnel wies leider Baumängel auf und musste am 15. Februar 1932 stillgelegt werden; nachdem er im Krieg durch einen Bombentreffer schwer beschädigt und von Spreewasser geflutet wurde, wurde er nach 1945 zugeschüttet. Die Straßenbahn besaß außerdem einen zweiten Tunnel, den Lindentunnel, mit dem die Prachtstraße Unter den Linden unterirdisch gekreuzt werden konnte – Kaiser Wilhelm II. wollte den Boulevard nicht durch die Oberleitungen einer elektrischen Straßenbahn verunstaltet sehen.